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微衛(wèi)星不穩(wěn)定那些事兒
瀏覽次數(shù)：5062 發(fā)布時(shí)間：2019-11-13
作者：李笑榮
一：什么是微衛(wèi)星不穩(wěn)定
微衛(wèi)星為生物基因組中短核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列，由于其重復(fù)特性，在DNA復(fù)制過程中易生錯(cuò)誤。在正常細(xì)胞中DNA錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)糾正DNA復(fù)制過程出現(xiàn)的錯(cuò)誤，確保復(fù)制過程的"保真性"。然而，當(dāng)DNA錯(cuò)修（ mismatch repair，MMR）基因(主要是MLH1、PMS2、MSH2、MSH6)發(fā)生胚系突變或體細(xì)胞MLH1啟動子過度甲基化導(dǎo)致MMR蛋白表達(dá)缺失時(shí)，微衛(wèi)星復(fù)制錯(cuò)誤不能被糾正即發(fā)生MSI。
近些年，在我國結(jié)直腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。其發(fā)生途徑按照分子變化分為（1）以DNA微衛(wèi)星改變?yōu)樘卣鞯奈⑿l(wèi)星不穩(wěn)定型(microsatellite instability，MSI)；（2）以部分或整個(gè)染色體為途徑的染色體不穩(wěn)定型(chromosomal instability，CIN)。結(jié)直腸癌約15%經(jīng)MSI途徑發(fā)生。其中約12%為散發(fā)性 MSI 結(jié)直腸癌，發(fā)生機(jī)制為MLH1 基因啟動子發(fā)生甲基化使該基因沉默、發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而致的 CRC。此外，由 MLH1、 PMS2、 MSH2、 MSH6 等 MMR 基因發(fā)生胚系突變所致Lynch 綜合征，約占3%。該綜合征是一種常染色體顯性遺傳病?；颊叱税l(fā)生結(jié)直腸癌，還可發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、膽管細(xì)胞癌等腸外腫瘤。
圖1 MSI途徑發(fā)生的結(jié)直腸癌
MSI國際研究合作組織推薦對Bat26、Bat25、D5S346、D2S123和D17S250五個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行檢測，根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定的數(shù)量對MSI進(jìn)行分類。（1）高頻MSI(MSI–H)：具有兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)改變；（2）低頻MSI(MSI–L)：僅有一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變；（3）微衛(wèi)星穩(wěn)定型(MSS)：沒有位點(diǎn)發(fā)生改變。通常，由于MSI-L與MSS的臨床表現(xiàn)無明顯差別，所以將MSI-L劃入MSS中。
二：為什么檢測MSI結(jié)直腸癌MSI結(jié)直腸癌與MSS結(jié)直腸癌相比，在預(yù)后、治療等方面均存在差異，而且與lynch綜合征密切相關(guān)。MSI結(jié)直腸癌檢測臨床意義包括以下三個(gè)方面。
（1）預(yù)后性：臨床研究發(fā)現(xiàn)，在Ⅱ期結(jié)直腸癌，MSI狀態(tài)可作為預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子，
如圖2所示，MSI-H Ⅱ期結(jié)直腸癌5年無復(fù)發(fā)生存率高于MSS Ⅱ期結(jié)直腸癌。即在Ⅱ期結(jié)直腸癌患者中，MSI-H狀態(tài)提示良好預(yù)后。
圖2 MSI-H Ⅱ期結(jié)直腸癌5年無復(fù)發(fā)生存率高于MSS Ⅱ期結(jié)直腸癌
（2）預(yù)測性：指導(dǎo)治療
5-氟尿嘧啶（5-FU）是結(jié)直腸癌術(shù)后輔助治療的重要化療藥物。Piero Benatti等開展回顧性研究發(fā)現(xiàn)，MSI-H Ⅱ期結(jié)直腸癌患者對5-FU治療不敏感。NCCN指南指出MSI-H Ⅱ期結(jié)直腸癌患者有良好預(yù)后但不能從5-FU治療獲益。
（3）Lynch綜合征的輔助診斷及篩查
Lynch綜合征家族不僅發(fā)生結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)增高，還可以發(fā)生子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌以及膽管細(xì)胞癌等腸外腫瘤。從MSI-H結(jié)直腸癌中篩選出可疑患者，就個(gè)人而言早期診斷和預(yù)防性息肉切除術(shù)可以降低CRC死亡率。此外，還可以為患者家族成員提供腫瘤預(yù)防和篩查。研究表明，阿司匹林能夠預(yù)防Lynch綜合征相關(guān)腫瘤的發(fā)生。
三: 怎么檢測MSI 微衛(wèi)星不穩(wěn)定？在MSI結(jié)直腸癌中，MSI是分子特征，DNA錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷是分子特征。因此，目前可用免疫組化檢測DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）基因相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及基于PCR檢測多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。
（1）免疫組化檢測DNA錯(cuò)配修復(fù)蛋白：常規(guī)開展4 種MMR蛋白檢測（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6。錯(cuò)修復(fù)蛋白在正常腸腺上皮細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞均表達(dá)，可作為內(nèi)對照。對單個(gè)錯(cuò)修復(fù)蛋白來說，當(dāng)內(nèi)對照細(xì)胞核陽性而癌細(xì)胞全陰性（即沒胞核著色）時(shí)，表明該蛋白表達(dá)缺失。總體上說，當(dāng)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)修復(fù)蛋白缺失時(shí)，可判讀為錯(cuò)配修復(fù)基因缺失（ MMR deficient， dMMR），提示腫瘤為MSI-H；當(dāng)腫瘤細(xì)胞無錯(cuò)修復(fù)蛋白缺失，判讀為錯(cuò)配修復(fù)基因無缺失（MMR proficient， pMMR），提示腫瘤為 MSI-L 或 MSS。
圖3 免疫組化檢測結(jié)直腸癌DNA錯(cuò)修復(fù)基因（MLH1、PMS2、MSH2、MSH6）表達(dá)
（2）PCR檢測多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)：該方法通過PCR擴(kuò)增特定的微衛(wèi)星序列（Bethesda指南5個(gè)位點(diǎn)），然后通過基因分析儀測序，最終比較正常和腫瘤組織的微衛(wèi)星長度差異。如前所述，然后根據(jù)微衛(wèi)星位點(diǎn)不穩(wěn)定的數(shù)量，判讀為MSI–H（具有兩個(gè)或兩個(gè)以上位點(diǎn)改變）、MSI–L（僅有一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生改變)、MSS（沒有位點(diǎn)發(fā)生改變）。
總體來說，免疫組化和PCR兩種檢測方法的敏感度和特異性均在90 %以上，且文獻(xiàn)報(bào)道二者一致率可以達(dá)到97.8 %以上。錯(cuò)修復(fù)蛋白免疫組化檢測結(jié)果如表1所示，其中最常見的免疫組化表達(dá)模式為MLH1-/PMS2-和MSH2-/MSH6-。與PCR方法相比，IHC檢測結(jié)果可以揭示缺失的基因種類，有利于下一步基因測序分析或進(jìn)一步篩查Lynch綜合征。免疫組化由于簡單、經(jīng)濟(jì)且更易于在病理科開展推廣。此外，免疫組化對組織樣本量要求不高，穿刺活檢也適用。所以，免疫組化檢測結(jié)直腸癌組織MMR可以作為一種初篩的手段。需要注意的是，少數(shù)錯(cuò)義突變導(dǎo)致錯(cuò)修復(fù)蛋白功能異常，由于保留“抗原性”導(dǎo)致免疫組化檢測出現(xiàn)假陽性。PCR方法則可互補(bǔ)，但由于技術(shù)相對復(fù)雜、費(fèi)用較高使得在基層病理科較難推廣。
在正常的組織炎癥反應(yīng)中，PD-1/PD-L1通路是T細(xì)胞免疫反應(yīng)的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。腫瘤細(xì)胞通過高表達(dá)PD-L1與活化的T細(xì)胞表面PD-1結(jié)合，就像給免疫系統(tǒng)“踩剎車”。如果特異性阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合即給免疫系統(tǒng)“松剎車”。各大藥廠基于這樣的原理研發(fā)一系列藥物，如以PD-1為藥物靶點(diǎn)的Pembrolizumab(Keytruda)、 Nivolumab(Opdivo)，以PD-L1為靶點(diǎn)的Tecentriq、Durvalumab。且抗PD-1/PD-L1免疫治療在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌等均有較好的治療響應(yīng)率。
關(guān)于抗PD-1/PD-L1免疫治療在結(jié)直腸癌中的作用，最初嘗試的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示33例結(jié)直腸癌患者僅有1例得到緩解。得到緩解的這位患者與其他有何不同？2015年， Le DT等發(fā)表在New England journal of medicine里程碑式的發(fā)現(xiàn)：抗PD-1藥物Pembrolizumab在錯(cuò)配修復(fù)缺陷(dMMR)的結(jié)直腸癌患者中反應(yīng)率顯著提高。該臨床試驗(yàn)患者分成3組：A:10位錯(cuò)修復(fù)缺陷(dMMR)結(jié)直腸癌患者、B：18位錯(cuò)修復(fù)無缺陷(pMMR)結(jié)直腸癌患者、C：7位錯(cuò)修復(fù)缺陷(dMMR)的其他腫瘤（除了結(jié)直腸癌）。如表2所示，免疫相關(guān)客觀反應(yīng)率分別為40%、0、70%，免疫相關(guān)20周無進(jìn)展生存率(%)分別為 78%、11%、67%。數(shù)據(jù)顯示不僅dMMR的結(jié)直腸癌患者獲益，而且dMMR的非結(jié)直腸癌患者，如子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌等也可從抗PD-1治療獲益。提示dMMR腫瘤患者均可從抗PD-1治療獲益。6月8日，Dung T. Le等science發(fā)表了《Mismatch-repair deficiency predicts response of solid tumors to PD-1 blockade》，該研究評估了PD-1抗體對12種dMMR腫瘤的治療效果（圖4），進(jìn)一步證實(shí)了抗PD-1免疫治療針對dMMR腫瘤患者的“實(shí)力”。
表2 MMR與抗PD-1臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
dMMR, CRC （ A ） | pMMR, CRC(B) | dMMR, 非 CRC(C) | |
免疫相關(guān) 客觀反應(yīng)率 (%) | 40 | 0 | 71 |
95%CI | 12-74 | 0-20 | 29-96 |
免疫相關(guān) 20 周 無進(jìn)展生存率 (%) | 78 | 11 | 67 |
95%CI | 40-97 | 1-35 | 22-96 |
中位隨訪時(shí)間 ( 周 ) | 36 | 20 | 21 |
圖4 PD-1免疫治療獲益的12種腫瘤類型
至于dMMR患者為什么能從抗PD-1治療獲益的機(jī)制并不清楚。文獻(xiàn)報(bào)道可能的機(jī)制：dMMR結(jié)直腸癌更容易被T細(xì)胞浸潤。對腫瘤細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn)dMMR結(jié)直腸癌在腫瘤浸潤面、腺癌細(xì)胞間和腫瘤間質(zhì)中有更多的CD8+以及輔助T細(xì)胞浸潤。此外，dMMR與pMMR相比，突變累積，產(chǎn)生更多“新抗原（Neoantigen）”,更易被免疫系統(tǒng)識別，這也是獲益的可能機(jī)制。
《2017 NCCN結(jié)直腸癌指南》推薦PD-1免疫治療單抗pembrolizumab和nivolumab可用于dMMR/MSI-H結(jié)直腸癌晚期治療。此外，5月23日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)Keytruda用于所有具有高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或者錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）實(shí)體瘤患者的治療。這是首次不分腫瘤類型，僅考慮腫瘤標(biāo)志物治療藥物。從“同病異治”到“異病同治”，具有劃時(shí)代的意義。
圖5 PD-1/PD-L1與dMMR
五：腫瘤負(fù)荷腫瘤突變負(fù)荷（Tumor Mutation Burden,TMB），通常定義為每個(gè)癌癥病人外顯子測序每百萬堿基（MB）的非同義突變數(shù)目。文獻(xiàn)資料顯示TMB可能成為腫瘤潛在的生物標(biāo)記物。美國紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心的Leonard B. Saltz等報(bào)告的一項(xiàng)研究對224例結(jié)直腸癌患者通過自定義雜交捕獲進(jìn)行二代測序，腫瘤突變負(fù)荷按照除拷貝數(shù)及結(jié)構(gòu)重排的非同義突變數(shù)目計(jì)算，并同時(shí)進(jìn)行免疫組化檢測錯(cuò)修復(fù)基因表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)193例錯(cuò)配修復(fù)基因正常(pMMR)患者突變數(shù)＜20；突變數(shù)≥20的31例患者中，28例（90%）是錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷(dMMR)。剩余的3例因?yàn)榫S護(hù)基因組穩(wěn)定的基因PLOE發(fā)生P286R突變，伴有高負(fù)荷突變，導(dǎo)致3例pMMR突變數(shù)均＞150，這種情況也很容易被識別。
圖6 結(jié)直腸癌中的腫瘤突變負(fù)荷情況
如圖6所示，作者將突變負(fù)荷設(shè)定為≥20且＜150定義為dMMR,，則用基因二代測序預(yù)測MMR的狀態(tài)的靈敏度和特異性都是1.0（95%CI，0.93~1.0）。該研究基于dMMR腫瘤中突變累積較多，將MMR狀態(tài)與腫瘤負(fù)荷建立對應(yīng)關(guān)系。提示TMB可作為結(jié)直腸癌MMR檢測的標(biāo)志物。
基因科技相關(guān)產(chǎn)品（一） 錯(cuò)修復(fù)蛋白（免疫組化法）
名稱 | 貨號 | 克隆號 |
MLH1 | GT2189 | ES205 |
MSH2 | GT2105 | 25D12 |
MSH6 | GT2195 | EP49 |
PMS2 | GT2159 | EP51 |
（二） 焦磷酸測序技術(shù)服務(wù)
焦磷酸測序以目標(biāo)DNA的一條單鏈為模板，以測序引物作為引導(dǎo)鏈，通過四種酶的級聯(lián)反應(yīng)將核苷酸鏈的延伸過程轉(zhuǎn)化成熒光信號。
1 MLH1 甲基化檢測
MLH1 屬于 MMR 家族的錯(cuò)配修復(fù)基因，是細(xì)菌錯(cuò)配修復(fù)基因 mutL 的同源物。該基因定位于 3p21，其基本功能是與其它的 MMR 蛋白相互作用形成一種多聚復(fù)合物，消除 DNA 復(fù)制過程中由于 DNA 聚合酶滑移而引起的堿基錯(cuò)配、插入以及缺失的形成。MHL1 基因啟動子區(qū)的甲基化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
在結(jié)直腸癌中，15%經(jīng)MSI途徑發(fā)生。其中約12%為散發(fā)性 MSI 結(jié)直腸癌，發(fā)生機(jī)制為MLH1 基因啟動子發(fā)生甲基化使該基因沉默、發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定性而致的 CRC。此外，由 MLH1、 PMS2、 MSH2、 MSH6 等 MMR 基因發(fā)生胚系突變所致Lynch 綜合征，約占3%。如圖7所示，lynch綜合征與散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌的鑒別篩查過程中,MLH1啟動子甲基化檢測在篩查中起重要作用。
圖7：lynch綜合征與散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌的鑒別篩查過程
2 B-raf 基因突變檢測
B-raf 是一種癌基因，它編碼一種絲/蘇氨酸特異性激酶，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生物學(xué)事件，如細(xì)胞生長、分化和凋亡等。研究表明，在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肺癌、甲狀腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的 B-raf 基因突變，約 66% 惡性黑色素瘤和15％的結(jié)腸癌中 B-raf 基因存在體細(xì)胞錯(cuò)義突變。大約 80-90% 的 B-raf 基因突變發(fā)生在 exon15的 1799 核苷酸上，T 突變?yōu)?A，導(dǎo)致其編碼的谷氨酸由纈氨酸取代 (V600E)。目前認(rèn)為，V600E 突變可模擬 T599 和 S602 兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化過程，從而使 B-raf 蛋白異常激活。
在結(jié)直腸癌中，散發(fā)性的MSI結(jié)直腸癌約有63.5%存在B-raf V600E突變，但lynch綜合征中基本無B-raf V600E突變。如圖7所示，B-raf V600E突變可以用于lynch綜合征與散發(fā)性MSI結(jié)直腸癌的鑒別診斷。
此外，2013 年 4 月出版的美國醫(yī)學(xué)協(xié)會雜志（journal of american medical association，JAMA）報(bào)道了 BrafV600E 對甲狀腺人乳頭瘤（Papillary Thyroid Cancer, PTC）預(yù)后的影響。文章指出 BrafV600E 突變極大的影響了 PTC 病人的存活率等一系列預(yù)后指標(biāo)。B-raf 突變狀態(tài)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及臨床結(jié)局有關(guān)。隨著 B-raf 突變研究的深入，可望為闡明腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的治療途徑與靶點(diǎn)提供思路。
參考文獻(xiàn)：
參考文獻(xiàn)太多，此處不一一列舉。
